Método INTG-HPV para Determinação Direta dos Padrões dos Status Físico do Genoma do HPV em Relação ao Genoma das Células Infectadas

Autores: Marla Simone Lopes Rodrigues (Pesquisadora Graduada em Ciências Farmacêuticas/Bioquímicas pela UPFB); Prof. Dr. Eleonidas Moura Lima (Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – PGBCM/CCEN/UFPB); Rodrigo Vilar Marques (Mestre em Biologia Celular e Molecular pelo PGBCM/CCEN/UFPB)

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A presente invenção se refere às áreas de biologia molecular e diagnóstico molecular in vitro, consiste na determinação direta dos status físico do genoma do HPV em relação ao genoma das células infectadas, que podem desenvolver processos neoplásicos, a exemplo do Câncer do Colo do Útero-CCU. O método IntG-HPV foi validado em amostras de DNA das linhagens celulares de CCU SiHa, Ca Ski e das células de descamação do colo uterino com lesões de baixo grau e positivas para HPV-16, por reação de PCR-Multiplex.

A análise comparativa pelo teste exato de Fisher apresentou diferença estatisticamente significativa valor-p > 0,05. Assim, os resultados sugerem as associações dos padrões Epissomal, Misto e Integrado do genoma do HPV-16 às referidas células de descamação, à linhagem celular Ca Ski e à linhagem celular SiHa, respectivamente. Portanto, o método IntG-HPV inova na análise direta da integração do genoma do HPV ao genoma da célula infectada, sendo teste molecular de diagnóstico e prognóstico para o rastreamento e a prevenção do CCU.

Fundamentos da invenção:

No Brasil, excluídos os tumores de pele não melanoma, o Câncer do Colo do Útero - CCU é o terceiro tipo de câncer mais incidente entre as mulheres atendidas pelo sistema público de saúde, os óbitos por CCU ocupam o terceiro lugar no país, representando 6,1% do total, com taxa média nacional de mortalidade praticamente constante no período entre 1980 a 2020 (INCA, 2022).

A principal causa na etiologia do CCU é infecção pelo Papiloma Vírus Humano – HPV seguida pela integração do seu genoma ao genoma das células infectadas (Zur Hausen, 2002).  A princípio ocorre a infecção do epitélio metaplásico por um ou mais subtipos de HPV de alto risco oncogênico, progressão clonal do epitélio infectado para lesões precursoras do câncer e invasão dos tecidos adjacentes são eventos relacionados à progressão tumoral (Moscicki et al., 2006).

Síntese da descrição da invenção:

O MÉTODO IntG-HPV PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DOS PADRÕES DOS STATUS FÍSICO DO GENOMA DO HPV EM RELAÇÃO AO GENOMA DAS CÉLULAS INFECTADAS, tem como alvo regiões do HPV, que determinam diretamente os padrões dos status físico Epissomal, Misto e Integrado do genoma do HPV em relação ao genoma da célula infectada, porém não se limita ao diagnóstico e prognóstico da infecção por HPV no rastreamento e na prevenção do CCU.

O método IntG-HPV inova na determinação direta da integração do genoma viral ao genoma da célula infectada e pode ser aplicada a outros vírus, que possuam genoma de DNA circular e apresentam comportamento molecular semelhante ao HPV, a exemplo dos poliomavírus humano, que causa o câncer de pele das células de Merkel (Feng et al. 2018).

A inovação do método IntG-HPV consiste na determinação direta dos padrões dos status físico Epissomal, Misto e Integrado do genoma dos subtipos de HPV de alto risco oncológico em amostras in natura de células de descamação e/ou biopsias do trato genital, entre outros, amplificados preferencialmente por PCR-Multiplex em regiões recombinantes e não recombinantes do genoma do HPV em relação ao genoma das células infectadas. 

O método IntG-HPV apresenta uma abordagem inovadora para a determinação dos status físico do genoma do HPV, em especial, dos subtipos de HPV de alto risco oncológico, a exemplo do HPV-16. O referido método, determina a mudança do genoma do HPV da forma epissomal para forma integrada diretamente nas células infectadas, sendo um método direto para determinação da integração do genoma dos subtipos de HPV de alto risco oncológico ao genoma das células infectadas.

O método IntG-HPV analisa as regiões dos genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7 do subtipo de HPV de interesse. No padrão epissomal são gerados obrigatoriamente amplicons específicos para o subtipo HPV de interesse, no padrão integrada, a depender de qual sítio de recombinação participa do mecanismo de integração, haverá ausência de amplicon específico.

A amplificação do método IntG-HPV foi realizada preferencialmente por PCR Multiplex utilizado amostras de DNA das linhagens celulares de CCU SiHa, Ca Ski e em 35 amostras de DNA de células de descamação do colo uterino com lesões de baixo grau e positivas para o HPV-16, preferencialmente no volume final 50μL, sendo 4µL do mix dos primers na concentração de 100pMol para cada região de recombinação e 2µL de amostras (no máximo 50ng de DNA por reação), 19µL água ultrapura livre de DNAse e RNAse e 25µL de MasterMix 2X (com DNA polimerase Hot start).

O KIT PARA DETECÇÃO DIRETA IN VITRO DOS PADRÕES EPISSOMAL, MISTO E INTEGRADO DO GENOMA DO HPV AO GENOMA DAS CÉLULAS INFECTADAS EM AMOSTRAS IN NATURA DE DESCAMAÇÃO DE CÉLULAS E/OU BIOPSIAS DO TRATO GENITAL E OUTRAS TRATOS, é caracterizado por ser utilizado no diagnóstico in vitro para determinação direta dos padrões moleculares epissomal, misto e integrado do genoma do HPV em amostras in natura de descamação de células e/ou biopsias do trato genital e outros tratos, sendo aplicado preferencialmente ao rastreamento e a prevenção do Câncer do Colo do Útero - CCU.

Currículo resumido de ELEONIDAS MOURA LIMA - Graduado em Ciências Biológica e Mestre em Genética e Biologia Molecular pela UFPA, Doutor em Ciências área de concentração em Genética pela Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP, Professor Associado IV da UFPB na cátedra de Genética e Biologia Molecular, docente permanente do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – PGBCM/CCEN/UFPB, coordenador do ferido programa nos períodos 2012-2014, 2017-2021, 2022, coordenador e pesquisador dos Projeto aprovados, executados e andamento junto ao Edital Universal/CNPq – 2008 (Executado); ao Edital PPSUS/FAPEPI – 2009 (Executado); à Chamada Pública MCTI/ FINEP/ CT-INFRA 01/2013 (Executado); à Seleção Pública MCTIC/FINEP/FNDCT - Subvenção Econômica à Inovação – 02/2020 (Executado); ao Edital FINEP/FAPESQ Nº 47/2021 Programa TECNOVA II PB (Executado), ao Edital Nº 07/2021 SEECT/FAPESQ/PB - Concessão de quotas de Bolsas de Mestrado Doutorado e Pós-Doutorado Acadêmicos (Executado); ao Edital Nº 12/2024 – SECTIES/FAPESQ/PB - Projeto Prevenção do Câncer de Colo do Útero , BR 10 2023 009924 (23/05/2023), INPI BR 10 2024 008016 5 (24/04/2024) e BR 10 2024 019535 3 (23/09/2024), junto ao INPI, sendo Sócio Cotista da empresa Bioensaios & Diagnósticos Laboratórios Clínicos Ltda.

Currículo resumido de MARLA SIMONE LOPES RODRIGUES - Graduada em Ciências Farmacêuticas/Bioquímicas pela UPFB, possui especialização em Saúde Pública pela FIP, atuou como Responsável Técnica do GENETIC – Laboratório de Biologia Molecular, no período entre 2018 a 2020, atuou como Coordenadora Geral do Projeto “Método DL-PCR para detecção de SARS-Cov-2, novo teste molecular para diagnóstico precoce da COVID-19" aprovado e executado junto à FINEP/MCTI, sendo coautora dos pedidos de patente: BR 10 2021 015901 4 (23/02/2023), BR 10 2023 009924 (23/05/2023), INPI BR 10 2024 008016 5 (24/04/2024) e BR 10 2024 019535 3 (23/09/2024), junto ao INPI é Sócia Administradora da empresa Bioensaios & Diagnósticos Laboratórios Clínicos Ltda.

Currículo resumido de RODRIGO MARQUES VILAR - Graduado em Biomedicina pela Faculdade Santa Emília de Rodat – UNIESP, possui especialização em Citologia Clínica pela Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Mestrado em Biologia Celular e Molecular pelo PGBCM/CCEN/UFPB, atual Responsável Técnico do GENETIC – Laboratório de Biologia; atuou como pesquisador auxiliar nos projetos "Método DL-PCR para detecção de SARS-Cov-2, novo teste molecular para diagnóstico precoce da COVID-19" e “implementação de kits de diagnóstico molecular in vitro para detecção de agentes infecciosos de interesse clínico baseados na plataforma molecular DL-PCR e implantação de unidade fabril” é coautor dos pedidos de patentes: BR 10 2023 009924 (23/05/2023), INPI BR 10 2024 008016 5 (24/04/2024) e BR 10 2024 019535 3 (23/09/2024), junto ao INPI.

Obs.: Resumo do artigo do pedido de patente do Método de Análise Direta de Integração do HPV, publicado na revista do INPI.